1.西南医科大学基础医学院，泸州 646000
2.中国科学院纳米酶工程实验室，蛋白质与多肽药物所重点实验室，中国科学院生物物理研究所，北京 100101
3.中国科学技术大学生命科学与医学部，合肥230000
4.纳米酶医学研究中心，郑州大学医学院，郑州，河南450052
本文主要介绍了纳米酶试纸条层析技术原理、分类、检测类型以及在各个领域中的应用前景。
1 纳米酶试纸条层析技术及原理
1.1 纳米酶
纳米酶（Nanozyme）是一类本身蕴含类酶特性的纳米材料，是新一代人工酶，具有多种酶模拟活性、高稳定性、独特的表面化学性质、易于表面调节和生物相容性等诸多优点，它克服了天然酶制备困难、成本高、易失活等问题。利用纳米材料的物理化学性质为即时检验（point-of-care testing, POCT）技术的发展提供了新思路。
1.2纳米酶试纸条层析技术 原理
纳米酶试纸条层析技术原理是将己知的特异性抗体（抗原）固定在硝酸纤维素膜上作为检测带，将与之配对的另一个抗体（抗原）与纳米酶进行偶联，形成纳米酶-抗体（抗原）复合物作为检测探针，当加入待检样品后，若样品中含有待检物，首先会被探针捕捉，形成抗原抗体纳米酶复合物，随着层析液继续向前泳动，到达检测线与包被抗体（抗原）发生高特异性和高亲和力的免疫反应，产生一条明显的检测带，多余的探针则继续向前到达质控线被捕捉。若样品中不含目标分析物，则与纳米酶探针一起到达质控线。最后经酶信号放大进行定性或半定量分析的检测过程（图1）。
图1 纳米酶试纸条原理图
2 纳米酶及其显色/发光类型
近年来，越来越多的纳米酶被发现具有多种类酶活性。不同纳米酶表现出来的不同类酶活性及其在体外检测中的应用见表1。可见，纳米酶能选择性的检测多种标志物，以类过氧化物酶应用最广泛。常用比色法进行酶信号放大提高试纸条检测灵敏度，除此以外，化学发光、荧光法也有涉及。
表1 不同纳米酶在即时检验中催化类型总结
3 纳米酶试纸条层析技术的检测类型
3.1蛋白质检测
3.1.1 夹心法
夹心法包括双抗体夹心法和双抗原夹心法。纳米酶上标记待测物的单克隆抗体（抗原），检测线（T线）包被针对待测物另一位点的单克隆抗体（抗原），质控线（C线）包被纳米酶标记抗体的二抗。当待测物为阳性样本时，待测物同时与纳米酶标记抗体和T线处包被受体（抗原或抗体）结合形成一个夹心结构，在T线处聚集显色，多余的纳米酶标记抗体继续层析至C线与包被二抗结合而显色。T线和C线均显色为阳性结果；T线不显色，C线显色为阴性结果；T线和C线均不显色为无效结果。
3.1.2 竞争法
常用来检测抗原分子，纳米酶垫上包被的纳米酶标记抗体或抗原和待测物与T线处包被的抗原或抗体进行竞争性结合。当待测物为阳性样本时，待测物中的抗体与T线包被的抗体可竞争性结合纳米酶标记抗原，导致T线上包被的抗体无法和纳米酶标记抗原结合，则T线无法显色。T线和C线均显色为阴性，T线不显色C线显色为阳性，T线和C线均不显色为无效结果。
3.2核酸检测
目前研究最广泛的是将核酸扩增与试纸条相结合进行检测。与传统的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术相比，具有操作简单、检测时间短、检测范围广等优点。
4 纳米酶试纸条层析技术的应用
4.1医学诊断
陈建甫教授团队[16]研制了检测金黄色葡萄球菌的钯@铂过氧化物纳米酶试纸条，可以在30分钟内检测到金黄色葡萄球菌的生物标志物蛋白A，检测限为9.56 ng/mL，灵敏度高、快速便捷。阎锡蕴院士课题组开发了一种基于Co–Fe@hemin过氧化物纳米酶的新型化学发光试纸条检测方法，用于快速、灵敏地检测SARS-CoV-2抗原。这种方法对SARS-CoV-2重组加标抗原的检出限为0.1 ng/mL，线性范围为0.2-100 ng/mL。结果表明，假病毒试验的灵敏度可达360 TCID50/mL，与ELISA法相当，特异性好，无交叉反应，可以在16分钟内完成。
4.2食品安全
喻理研究员和李培武院士团队制备了一种具有高效催化性能的Fe-N-C单原子过氧化物纳米酶试纸条， 对黄曲霉毒素B1和伏马菌素B1的检测限分别为2.8 pg/ mL和13.9 pg/ mL，分别比欧盟规定的最大检测限低700和71000倍以上。17β-雌二醇普遍存在于各类环境，对健康和生殖影响大。张道宏教授课题组提出一种基于多功能NiCO2O4(NCO)的更新的用于17β-雌二醇检测的试纸免疫测定法。在10分钟以内可以完成。在比色和催化信号下的检测范围分别为0.9541-8 ng/mL和0-30 ng/mL，相关系数分别为0.9541和0.9962，且该检测具有良好的特异性和满意的回收率(86.2-107.6%)。
4.3农业
Cai等构建了一种检测黄曲霉毒素B1的MnO2过氧化物纳米酶试纸条。该检测方法的检测限为15 pg/mL，比欧盟(EU)规定的食品中黄曲霉毒素B1的最高检测限低100倍以上。此外，该试纸条可提供7个动态检测范围，跨越4个数量级，可满足不同国家对食品和饲料中黄曲霉毒素B1残留限量的要求。估计回收率在85.67%-106.38%的范围内，变异系数(Coefficient of Variation,CV)小于9.68%。符娜等建立了莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条法，灵敏度为100 ng/mL。该方法成本低、检测快速和灵敏度高，为口岸病毒检测提供了一种新的检测技术。
5 总结和展望
通过上述最近的例子，有力的证明了将纳米酶应用到即时检验中有着光明的前景。但是由于纳米酶试纸条层析技术存在诸多的不足，仍有许多问题需要解决。
（1）类酶活性及灵敏度。尽管许多纳米材料被报道有多种类酶活性，但是仅有类过氧化物酶占主导地位用于即时检验应用，鉴于天然酶的多样性应致力于制定更多新的战略。同时，纳米酶试纸条层析技术的灵敏度主要依赖于取决于纳米酶的催化效率。而很少有例子证明纳米酶的催化活性在即时检验中增强灵敏度发挥巨大作用。
（2）定量检测。目前大多数纳米酶试纸条用于定性检测，主要通过肉眼观察颜色变化进行结果判读。但是在临床上，定量检测能够给疾病的诊断带来更多的帮助，因此，在未来定量检测的研究也很重要。
（3）多样本检测。目前大多数纳米酶试纸条是针对单一检测物进行分析的，很少有文献报道能对两种或以上检测物同时检测。在大环境下，更多需要的是对复杂条件进行快速分析的检测方式。研究纳米酶试纸条对多种检测物同时检测也是一个重要方向。
-End-
题图 | veer.com
排版 | 张宁
审校 | 方研
